PCR实验中DNA聚合酶的选择及实验方法

发布日期：2025-01-04 14:27    点击次数：181

一、 DNA聚合酶的选择 实验室常用 DNA聚合酶有三种：TaKaRa TaqTM，TaKaRa EXTaqTM和 PyrobestTMDNA Polymerase。TaKaRaTaqTM是一般的DNA 聚合酶，保真性较差，但价钱便宜，一般用于基因表达的检测等。TaKaRaEXTaqTM是具有 Proof reading活性的耐热性 DNA聚合酶，具有一定的保真性，而且其扩增得到的PCR产物 3’端附有一个 “A ”碱基，如果希望直接将产物克隆 到 T -vector可以用此酶。PyrobestTMDNA Polymerase 也是具有Proof reading 活性的耐热性DNA 聚合酶，其特点是保真性极高，扩增得到的 PCR产物为平滑末端。如果进行基因的扩增 请使用此酶。 二、按下列组成在PCR 反应管中调制反应液 TaKaRaTaqTM或TaKaRaE XTaqTM的配方 Reagent Quantity,for 50µ l of reactionmixture 10X PCR buffer （Mg2+free） 5 µl MgCl2（25mM） 如 TaKaRaTaqTM加 3 µl 如 TaKaRaEXTaqTM加 4 µl 2.5mMdNTP mix 4 µl 10µ M Primer 上游 1 µl 10µ M Primer 下游 1 µl TemplateDNA 1 µl Taq或E XTaqDNAPolymerase 0.25 µl Steriledeionizedwater Up to 50µl Total 50 µ l /Sample Reagent Quantity,for 50µ l of reactionmixture PyrobestTMDNA Polymerase的配方 10X Pyrobestbuffer 5µl 2.5mMdNTP mix 4µl 10µ M Primer 上游 1µl 10µ M Primer 下游 1µl TemplateDNA 1µl PyrobestTMDNA Polymerase 0.25µl Steriledeionizedwater Up to 50µ l Total 50µ l /Sample ①反应总体积根据实际情况进行调控，可以做 20~50µ l以节约试剂； ②将上表各成分加入到 0.2ml或 0.5ml灭菌的 PCR薄壁管中； 如果不用 PCR仪的加热盖，在反应混合液的上层加 30 ~ 50µ l的矿物油 防止样品在 PCR的过程中蒸发； 三、按以下程序进行PCR 扩增 PCR 反应条件视模板、引物等的结构条件不同而各异，在实际操作中需根据具体的情况以及 PCR结果而进行优化。 Step Temperature,° C Time,min Number of cycles Note 起始变性 94~95 1~3 1 变性 94~95 0.5~2 25~35 退火温度比理论退火温度大概低 5°C，再根据反应结果优化 退火 37-70 0.5~2 延伸 70-75 根据扩增产物的大小 每分钟延伸 1000bp 最终延伸 70-75 10 1 反应结束后，抽取扩增样品 5µ l，用琼脂糖凝胶电泳分析扩增结果，用DNA marker判断扩增片段的大小或冷冻保存，以备以后分析使用